一步制备特异性结合纳米抗体的免疫脂质体新技术

免疫脂质体具有大的有效负载能力、改变的药代动力学、改善的药物耐受性和增强的病灶特异性分布，在工业转化中遇到挑战，部分原因是缺乏具有成本效益的、可扩展的制造技术。现有的制备过程涉及费力的化学修饰，损害了靶向部分的稳定性。在漫长的生产过程中，有效载荷泄漏和产品损失也是不可避免的。尽管目前做出了努力，这些挑战仍然存在，并且由于生产成本高和批次间差异，免疫脂质体仍然对制造商没有吸引力。此外，选择全长抗体、抗体片段或适体作为靶向部分在尺寸、生物相容性和稳定性方面提出了挑战，从而损害了免疫脂质体的性能。相比之下，小尺寸、低免疫原性和稳定的纳米抗体（NB）适合作为靶向部分。       

2024年2月19日，美国宾汉姆顿大学Yuan Wan、Lixue Wang、布莱根妇女医院Luke P. Lee等人在Nat. Nanotechnol.发表的题为Chimeric nanobody-decorated liposomes by self-assembly的论文报告了一种一步制备免疫脂质体的新技术。该技术在细菌中产生的嵌合纳米抗体（cNB）由靶向人表皮生长因子受体2（HER2）的NB、柔性肽接头和人单跨膜结构域（STMD）组成。脂质、药物和 cNB 以优化的比例自组装成免疫脂质体。cNB 的整合可以改变脂质体的生物物理特性。该方法能够使用现有的生产管道进行免疫脂质体生产，显示出工业生产和临床使用的前景。

通过筛选282个菌落，确定了39个特异性结合HER2的纳米抗体（NB）。选择了一个Kd为0.53 nM的NB进行生产，优先选择大肠杆菌而不是CHO细胞，因为其成本效益更高。收集到的NB的EC50（半最大有效浓度）为0.54 nM。由于缺乏Fc结构域，未观察到抗体依赖性细胞毒性。NB抑制了HER2过度表达的SK-BR-3细胞，表明NB仅具有靶向作用。此外，NB在生理pH下呈负电荷。NB/HER2复合物通过互补结构、氢键和静电相互作用稳定。NB主要结合于HER2的IV和II结构域。设计的带有约20 nm长的(GGGGS)8连接子的cNB增强了活性，有利于靶向传递。将His6标签和STMD添加到cNB的N-末端和C-末端并未显著改变其结合亲和力或等电点。HER2携带的cNB显示出可靠的产量和高纯度，表明其进一步研究的潜力。

研究人员制备了cNB修饰的免疫脂质体（cNB-LNP），通过荧光抗His6抗体观察到了固定的cNBs。透射电镜显示cNB-LPs的膜厚度增加到约10 nm，而且表现出不规则的边缘。计算结果显示cNB聚集不稳定，且呈现散乱的α螺旋结构。荧光共振能量转移（FRET）实验证实了cNB整合到脂质体膜中。脂质体的膜流动性随温度增加而增加，而cNB-LPs则表现出较低的膜流动性。含有更多cNB的脂质体显示更高的热稳定性和膜刚度。在小角度X射线散射中，cNB-LP2000显示出与LPs和cNBs不同的模式，证实了cNBs的融入。cNB-LP2000表现出稳定的尺寸和形态，表明其在储存和温度条件下的可行性和稳定性。

cNB-LP2000成功装载了5-氟尿嘧啶（5FU），并且释放速率较慢，保持了药物的持续释放。在HER2过度表达的细胞系中，5FU-loaded cNB-LP2000的抗肿瘤活性显著增强，治疗效果优于常规LNP。小鼠模型进一步证实了cNB-LP2000对于HER2阳性肿瘤的疗效，显著抑制了肿瘤生长，并延长了小鼠的生存时间。该研究为靶向药物递送提供了新思路，有望在临床上应用于肿瘤治疗。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41565-024-01620-6